鴨源致病性大腸桿菌的分離鑒定及致病性觀察

來源：獸藥直銷網  發布日期：2012-04-30  發布者：曉天  共閱710次

鴨大腸桿菌病是影響養鴨場生產效益的主要疾病之一。據文獻資料顯示［1，2］，鴨大腸桿菌病在我國不同類型的養鴨場中普遍存在，流行廣泛，而使用抗生素防治該病，又易產生抗藥性，并且從這些報道看，我國分離到的鴨源性大腸桿菌的血清型眾多，不同地區差異較大。伴隨著規?；B鴨的發展和區域集約化養殖的擴大，加上環境與水源的污染加重，該病的危害日益嚴重，往往一個場發病，能導致集養區成片流行，而且鴨大腸桿菌病與傳染性漿膜炎混合感染較多，癥狀與病變較相似而不易區分，還具有垂直傳播的特點，這都會給養殖戶造成重大的經濟損失，因此對鴨大腸桿菌病的防治是非常重要的。
本研究從湖北荊州五三農場病變特征為纖維素性心包炎和肝周炎的患病的雛鴨腦內分離到1株細菌， 進行生化特性試驗、藥敏試驗、細菌16SrRNA 序列測定和動物回歸試驗，鑒定為致病性大腸桿菌，并用已分離鑒定的大腸桿菌經腹腔注射途徑感染15 日齡雛鴨，觀察雛鴨感染后的臨床癥狀、病理變化，進一步了解此分離菌株的病理變化、致病特點，闡明雛鴨感染大腸桿菌后發病特點，為進一步探討其發病機理和臨床防治提供資料。
1 材料和方法
1．1 試驗動物
湖北荊州五三農場送檢疑似感染病鴨；1 日齡櫻桃谷雛鴨10 羽，購自武漢市畜牧科學研究所。
1．2 大腸桿菌的分離及初步鑒定
用無菌接種環取凍存的麻鴨頭的腦，劃線接種于普通瓊脂和麥康凱瓊脂平板，37℃培養18～24 h，在麥康凱瓊脂平板上挑取可疑菌落在普通瓊脂斜面上進行純培養，37℃培養18～20 h。再挑取純培養物涂片、革蘭氏染色，觀察細菌形態及染色特征。
1．3 生化試驗
將符合大腸桿菌形態特征的細菌接種于普通瓊脂斜面，37℃培養24 h，挑取適量細菌接種于生化試驗微量發酵管（葡萄糖、棉子糖、甘露醇、尿素分解管、賴氨酸、苯丙氨酸、鳥氨酸、半固體瓊脂、蛋白胨水、硫化氫、枸櫞酸鹽、側金盞花醇、木糖、葡萄糖磷酸鹽、山梨醇），37℃培養24～72 h，觀察并記錄結果。
1．4 藥敏試驗
按照WHO 推薦的紙片擴散法Kirby－Barer 氏法進行［5］，測定大腸桿菌對青霉素、氨芐青霉素、丁胺卡那霉素、氧哌嗪青霉素、丙氟哌酸、頭孢膚肟、復方新諾明、復達欣、先鋒鉍素、先鋒霉素Ⅳ、苯唑青霉素、美滿霉素、痢特靈、麥迪霉素、強力霉素、奧復星、青霉素17 種常用抗生素藥物的敏感性。
1．5 鴨源大腸桿菌的16S rRNA 的PCR 檢測
從TSA 平板中挑單菌落于5 mL LB 培養基中，37℃ 200 r ／min 振蕩培養3 h，使用細菌基因組DNA提取試劑盒（天根公司，批號：G5807），按其說明進行基因組DNA 提取。
使用細菌16S rDNA 通用引物［6］， 上游P0：GAGTTTGATCMTGGCTCAG；下游Pc3：CTAHAGGG
TATCTAATCCT 進行擴增，反應體系50 uL，反應條件為95℃ 5min，隨后94℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃ 90s，共30 個循環，72℃延伸10 min。擴增產物檢測采用常規瓊脂凝膠電泳（1％瓊脂糖，GENETECH 公司，0．5 μL ／mL EB，0．5×TBE），120V 20 min，使用凝膠成像系統（UVP 公司）觀察結果。利用凝膠片段回收試劑盒（天根公司，批號：DP209－02）將陽性條帶回收純化， 常規方法連接pMD－18T 后轉化大腸桿菌DH5α，進行測序（Invitrogen 公司）。
1．6 致病性試驗
1．6．1 動物分組及處理1 日齡櫻桃谷雛鴨10 羽，空白飼養14 d 經血液檢查無細菌感染后，于15 日齡隨機分為2 組，分別為腹腔組和對照組，每組5羽。鑒定出的大腸桿菌接種于營養肉湯培養基，37℃振蕩培養18 h，4 000 r ／min 離心20 min， 用滅菌生理鹽水配制細菌濃度為3×108cfu/mL 菌懸液備用。腹腔組雛鴨經腹腔內注射途徑接種上述制備大腸桿菌菌懸液，每羽0．5 mL。對照組常規飼養管理，不作處理。
1．6．2 臨床癥狀觀察及樣品處理感染后每天上、下午各記錄一次雛鴨的最早死亡時間和死亡數，剖檢觀察病變，并以心血、肝臟、腦作細菌分離、鑒定，感染后7 d 撲殺仍存活的雛鴨剖檢觀察病變并作細菌分離鑒定。采取脾臟、心臟、肝臟、肺臟、腎臟、腦、胸腺、法氏囊置于10％中性福爾馬林溶液中固定，備作組織病理學觀察。
1．6．3 組織病理學觀察對采取的組織進行常規石蠟包埋、切片、HE 染色，最后在光學顯微鏡下觀察結果，并采用NIS－Elements 高清晰度彩色圖文分析系統記錄。
2 結果與分析
2．1 大腸桿菌的分離及初步鑒定
分離菌的培養特性及形態特征： 經37℃培養24～48 h，在麥康凱瓊脂上形成紅色、圓形、隆起、光滑濕潤、邊緣整齊的中等大菌落；在普通瓊脂斜面上為灰白色菌落；取培養物涂片，革蘭氏染色，鏡檢能見到革蘭氏陰性、兩端鈍圓的短桿菌。
2．2 生化試驗結果
生化試驗結果顯示分離的大腸桿菌對葡萄糖、尿素、山梨醇、半固體瓊脂、賴氨酸、鳥氨酸試驗為陽性；硫化氫、葡萄糖磷酸鹽、蛋白胨水、側金盞花醇、棉子糖、苯丙氨酸、枸櫞酸鹽、木糖試驗為陰性。
2．3 藥敏試驗結果
對分離出的大腸桿菌進行了藥敏試驗，此次鴨場分離的大腸桿菌對氧哌嗪青霉素、丙氟哌酸、頭孢膚肟、復方新諾明、先鋒鉍素、美滿霉素、痢特靈、強力霉素、奧復星、青霉素高度敏感，對丁胺卡那霉素、復達欣中度敏感，對氨芐青霉素、先鋒霉素Ⅳ、苯唑青霉素、麥迪霉素耐藥。
2．4 鴨源大腸桿菌的16S rRNA 的PCR 結果及測序
PCR 結果在約750bp 處有一特異性條帶，如圖1。將測序結果與Genbank nr 數據庫進行Blast 比對。結果與腸致病性大腸桿菌（E．coli EXPEC，acc：CP001969．1）、雞源致病性大腸桿菌（E．coli O1∶K1∶H7，APEC，acc：CP000468．1）、尿道致病性大腸桿菌
（E．coli UPEC，acc：CP000243．1）16S rRNA 部分序列均達到100％ 相似性， 與同科的志賀菌屬（EU009185）僅有1 個堿基差別，而與腸桿科其他屬同源性在98％以下，表明2 個菌屬同源性較高。結合培養特征，確定該菌為大腸桿菌。2．5 致病性試驗結果
2．5．1 試驗雛鴨的發病情況及臨床癥狀 腹腔組雛鴨感染后10 h，雛鴨死亡1 羽，其他雛鴨表現精神不振，頭部羽毛蓬松，食欲下降，排黃色稀糞；感染后1 d，眼部分泌物增多，感染后3 d，全部死亡?？瞻讓φ战M雛鴨精神狀態和食欲正常，好動，羽毛光滑，生長速度快，全部存活。
2．5．2 試驗雛鴨的眼觀病理變化觀察結果 腹腔組：肝臟表面有一層黃白色的纖維素附著（圖2）且肝被膜與胸壁、心臟、腹膜發生粘連；脾臟呈網格狀充血腫大；腎臟腫大，呈紫紅色；法氏囊腫大，氣囊變渾濁，有少量黃色干酪樣分泌物。腹腔和腸管表面均有黃白色的纖維素附著（圖3）。對照組：各器官組織無明顯眼觀病理變化。
2．5．3 試驗雛鴨的組織病理變化觀察結果 腹腔組：心外膜增厚、淤血，心肌血管淤血；肝被膜增厚，呈漿液纖維素性滲出，內有細菌團塊；血管周圍間隙增寬，炎性細胞浸潤；肺臟淤血，血管周圍組織間隙增寬，血管周圍有炎性細胞圍繞，形成血管袖套現象（圖4） 且血管中有大量的細菌團塊存在（圖5），局部支氣管周圍有淋巴細胞浸潤；腎臟間質及腎小球內有輕微的淤血。對照組：各器官組織無明顯組織病理變化。
3 討論
本研究自湖北荊州五三農場送檢的病鴨腦組織中分離出可疑菌株并經一系列實驗室診斷，確定本次從病料中分離出的菌株為大腸桿菌，命名為JM株。
鴨大腸桿菌病一年四季均能發生，在冬春寒冷和氣溫多變季節多發，育雛溫度過低也能加重該病的發生，其病原通過污染的蛋殼、鴨的分泌物、排泄物、污染的飼料、水、食具、墊料、粉塵而傳播［7］。本試驗以腹腔注射途徑感染雛鴨，觀察分離菌株的致病特點，試驗結果顯示經腹腔注射途徑感染的雛鴨在感染3 d 內100％發生死亡，經細菌學檢查未發現其他細菌，感染雛鴨的組織病理學觀察可見感染雛鴨均表現出纖維素性肝被膜炎，纖維素性心包炎和氣囊炎，這與自然條件下大腸桿菌感染引起的病變相同［3，4］。說明此株鴨源大腸桿菌是一株致病性很強的強毒株。此外，感染雛鴨也表現有漿液性肺炎且在肺組織血管內可見大量細菌團塊，表明大腸桿菌對感染雛鴨肺臟也產生了病理損傷。
此次分離的大腸桿菌的藥物敏感試驗顯示對氧哌嗪青霉素、丙氟哌酸、頭孢膚肟、復方新諾明、先鋒鉍素、美滿霉素、痢特靈、強力霉素等藥物均高度敏感，因此可指導臨床治療用藥。大腸桿菌很容易產生耐藥性，能由染色體或質粒介導，它能通過菌毛將耐藥質粒傳遞給其他大腸桿菌，所以大腸桿菌的耐藥性形成較快，環境中大腸桿菌的耐藥性菌株越來越多。臨床上用藥的不合理也容易導致大腸桿菌的耐藥菌株的產生［4］。在實際用藥中應采取聯合、輪換、交叉等用藥形式，以減小細菌產生耐藥性的幾率，達到好的防制效果。

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