恩諾沙星酶聯免疫試劑盒質量標

來源：  發布日期：2011-09-03  發布者：曉天  共閱1719次

本品系用恩諾沙星（ENR）偶聯蛋白的抗原、恩諾沙星單克隆抗體和酶標記羊抗鼠及其它試劑制成。用于定量、定性檢測雞組織、蝦、魚和雞血清中ENR殘留量。

【物理性狀】試劑盒外觀完整，內裝試劑齊全。包被抗原的酶聯板透明干燥且用真空包裝，恩諾沙星（ENR）抗體工作液、底物液、終止液、標準品、濃縮洗滌液為透明液體，酶標記物為淺黃色溶液，試劑無菌檢驗均應合格。

【靈敏度測定】 取已包被好的酶標板12孔，每兩孔分別加入0?g/L、0.5?g/L、1.5?g/L、4.5?g/L、13.5?g/L、40.5?g/L標準溶液各50?L，再加入ENR抗體50?L，37℃反應30min，取出洗板5次，拍干，加入100?L酶標二抗，37℃反應30min，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50?L，避光37℃反應15min，用50?L/孔終止液終止反應，置450nm波長處測定吸光度值。每一濃度標準溶液吸光度值（B）平均值除以第一個標準（0標準）吸光度值（B0）的平均值再乘以100，即百分吸光度值。以ENR濃度（?g/L）的自然對數值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。

IC50（即0濃度標準溶液的吸光度值50％處所對應的ENR濃度）范圍應在1.45?g/L ~3.26?g/L之間。

【特異性測定】 取已包被好的酶標板18孔，每兩孔分別加入0?g/L、0.5?g/L、1.5?g/L、4.5?g/L、13.5?g/L、40.5?g/L標準溶液和陰性雞肉樣本提取液、10?g/kg和20?g/kg 兩個濃度ENR標準品添加的陽性雞肉樣本提取液各50?L，再加入ENR抗體50?L，37℃反應30min，取出洗板5次，拍干，加入100?L酶標二抗，37℃反應30min，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50?L，避光37℃反應15min，用50?L終止液終止反應，置450nm波長處測定吸光度值。每一濃度標準溶液吸光度值（B）平均值除以第一個標準（0標準）吸光度值（B0）的平均值再乘以100%，即百分吸光度值。以ENR濃度（?g/L）的自然對數為X軸，百分吸光度為Y軸，繪制標準曲線圖。從標準曲線中查出陰性樣品和10?g/kg和20?g/kg 兩個濃度ENR添加的組織樣品的測定濃度。

陰性樣品測定值均應在2.5?g/kg以下，10?g/kg和20?g/kg 兩個濃度ENR添加樣本回收率應在60%~110%之間。

【精密度測定】 取已包被好的酶標板32孔，每兩孔分別加入0?g/L、0.5?g/L、1.5?g/L、4.5?g/L、13.5?g/L、40.5?g/L標準溶液50?L，其它20孔加入4.5?g/L的標準溶液50?L，再加入ENR抗體50?L，37℃反應30min，取出洗板5次，拍干，加入100?L酶標二抗，37℃反應30min，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50?L，避光37℃反應15min，用50?L終止液終止反應，置450nm波長處測定吸光度值。

20個微孔的4.5?g/L標準溶液的吸光度值的變異系數（%）應≤25%（n=20）。

【適用范圍】用于定量、定性檢測雞組織（肌肉、肝臟等）、蝦、魚和雞血清中ENR殘留量。

【用法和結果判定】

1. 溶液的配制

1.1 0.1MNaOH溶液 　 0.4g　　 NaOH

　　　　　去離水100ml溶解

1.2 乙腈NaOH溶液　 將乙氰與0.1M NaOH溶液按84：16的體積比混合

1.3 PB緩沖液配制　 　0.52g　 Na2HPO4·12H2O

　　　　　　　　 　　 0.088g　 NaH2PO4·2H2O

去離水100ml溶解

1.4 稀釋洗滌液 將20X濃縮洗滌液搖勻，用去離子水以1：20的比例稀釋，臨用前配制。

2.　 樣品前處理

2.1　 雞組織（肌肉、肝臟等）樣本處理方法

2.1.1 稱取2.0g均質過的雞肉樣本于50mL離心管中。

2.1.2 加入乙腈 NaOH溶液10mL，充分混合10min，3000g以上，15℃離心10min。

2.1.3 取出5mL上清液，加入0.02M PB緩沖液2mL，混合均勻。

2.1.4 加入二氯甲烷5mL，充分混勻10min，3000g以上，15℃離心10min。去上層，取下層有機相到干燥瓶中（清亮無雜質），50℃旋轉蒸發至干或氮氣吹干。

2.1.5 用0.6mL 0.02M PB緩沖液溶解干燥的殘留物，加入正己烷1mL，混合2min，3000g, 15℃離心5min。

2.1.6 輕吸掉上層有機相和中間部份液體，取下層50μL溶液，再加入150μL 0.02M PB緩沖液混勻即可分析。

2.2 雞血清樣本處理方法

2.2.1 用加有肝素鈉（20~30單位/mL血）的離心管采集血樣本，血樣本室溫靜置1h，待析出血清后3000g，15℃離心10min，取出血清1mL。

2.2.2 加入3mL乙腈充分上下混合10min，3000g以上，15℃離心10min。轉移上清至另一離心管中，加入1mL 0.02M PB緩沖液，混勻。

2.2.3 加入二氯甲烷4mL，充分混勻10min，3000g, 15℃離心10min。去上層，取下層有機相到干燥瓶中（清亮無雜質），50℃旋轉蒸發至干或氮氣吹干。

2.2.4用0.6mL 0.02M PB緩沖液溶解干燥的殘留物，加入正己烷1mL混合2min，取出3000g以上，15℃離心5min。

2.2.5 輕吸掉上層有機相和中間白色雜質，取下層50μL溶液，再加入150μL PB緩沖液混勻即可分析。

2.3 水產品樣本的處理等同于雞組織樣本的處理方法

注：水產品提取中上述第1.2.5步，如果在兩相之間出現太多的泡沫或膠狀物，難以取出足夠的下層提取液，應將樣品瓶放在80℃水浴中5min后再離心。

3.　 檢測步驟

3.1 將試劑盒從冷藏環境中取出并將所需試劑從試劑盒取出，置室溫（20~24℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

3.2 按需要取好微孔條及板架，將不用的微孔板重新密封，保存于2~8℃，不要冷凍。

3.3 編號：將樣品和標準品對應微孔按序編號，每個樣品和標準品均需做2孔。

3.4 加標準品或樣本 50 mL /孔，然后加抗體工作液50 μL/孔，用蓋板膜蓋板，37℃水浴或恒溫箱反應30min。

3.5 取出用洗滌液按每孔250μL，洗板4~5次，每次浸泡10秒，拍干。

3.6 加酶標記物工作液，每孔100mL，用蓋板膜蓋板后置37℃水浴或恒溫箱反應30min。取出用洗滌液按每孔250μL，洗板4~5次，每次浸泡10秒，拍干。

3.7 顯色：每孔加入底物液A液50mL，再加B液50mL，輕輕振蕩混勻，37℃水浴或恒溫箱避光顯色15min。

3.8 測定：每孔加入2M終止液50mL，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測），測定吸光度值（OD值）。

4.　 結果判定

所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個標準（0標準）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。

百分吸光度值（%）＝
B
×100%

B0



B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0?g/L標準溶液的平均吸光度值

以標準品百分吸光率為縱坐標，以恩諾沙星標準品濃度（?g/L）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中恩諾沙星實際濃度。

若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣品的準確、快速分析。

【貯藏條件和保存期】

試劑盒應在2~8℃保存，保存期為6個月。

【規格】 每個試劑盒含96孔板一塊，ENR標準品6瓶 1mL/瓶（0?g/L、0.5?g/L、1.5?g/L、4.5?g/L、13.5?g/L、40.5?g/L），ENR抗體工作液1瓶，7mL；酶標二抗工作液1瓶，12mL；濃縮洗滌液1瓶，40mL；底物液7mL各一瓶；終止液1瓶，7mL/瓶；蓋板膜1張，自封袋1個；說明書1份；質量報告1份。

【注意事項】

1、劑盒在緩沖液配制和液體分裝上要做到無菌，防止試劑變質。

2、試劑盒標準品應經過嚴格配制后方可用于試劑盒中。

3、添加回收用的高濃度標準品需經過試劑盒自身標準驗證，合格后方可用于特異性和準確度監控用。

4、嚴格按照質量標準所述用法和結果判定內容進行試劑盒質量控制。

5、在試劑盒老化實驗中出現有不合格現象，則視該批試劑盒為不合格。

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