豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒引起的豬的一種急性腸道傳染病，是導致仔豬早期死亡的重要疫病之一。近年來，豬流行性腹瀉的流行區域有逐漸擴大的趨勢，已成為中國甚至世界最常見的豬腹瀉傳染病之一。通過對豬流行性腹瀉病毒基因組概述、S基因及其編碼蛋白的功能特性、基于豬流行性腹瀉病毒S基因的診斷技術及其疫苗研究進展等方面進行綜述，以期對豬流行性腹瀉病毒S基因研究以及豬流行性腹瀉的預防和控制提供幫助。

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豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病。豬流行性腹瀉的臨床癥狀以豬水樣腹瀉、嘔吐、脫水為主要特征。其發病特點是日齡越小癥狀越重，日齡越大癥狀越輕。本病多發生在春冬兩季，不同品種和年齡的豬群均易感染，哺乳仔豬、斷奶仔豬和育肥豬發病率可達100%，死亡率高達95%以上，給養豬業帶來重大經濟損失。英國首先于1971年報道了本病的發生，隨后比利時、德國、瑞士、日本等許多國家也報道了本病的發生。我國在1976年首次報道了PED的發生，并于1980年首次分離到病毒，以后許多地區均有本病的報道發生。1977年，比利時人從病料中分離出一株不同于TGEV的病毒，并命名為類冠狀病毒CV777株。

據報道，在歐洲地區，感染PED的育肥豬和妊娠母豬的臨床表現主要是發生輕微的腹瀉。相比之前，2000年之后豬流行性腹瀉的暴發頻率日漸減少，究其原因大都是由于規?；i場直接采取撲殺銷毀病豬的方法，該方法從源頭上切斷了豬流行性腹瀉的擴散，因此在這些地區該病的診斷研究和檢測報告也越來越難找到。

在亞洲地區卻呈現出不同的現象，PEDV的感染頻率一直持續大幅上漲，中國、泰國、韓國、日本感染PED的豬場都遭受到不同程度上的危害。因該病分布廣、發病急、對新生仔豬致死率高，給養豬業帶來了重大的經濟損失。到目前為止,我國已有26個省市自治區報道了PED的發生和流行情況,說明PED在我國己經廣泛存在,成為我國重要的豬傳染病之一,對國內的養豬業造成了巨大的經濟損失。2010年冬季以來，豬流行性腹瀉在我國又開始暴發流行，即使免疫商品化疫苗也難于控制，給國內的養豬業造成了重大經濟損失。2013年在美國迅速發病并在全美范圍內流行，2014年1月已在加拿大開始流行，該病已在世界范圍內造成嚴重影響。

1　PEDV 基因組概述

1955年，第5屆國際病毒命名委員會正式將具有冠狀病毒典型形態特征的PEDV列為冠狀病毒科成員。PEDV基因組屬于不分節的具有感染性的單股正鏈RNA,基因組全長28 kb左右[8],具有5’端的帽子結構(cap)和3’端的Poly (A)尾結構。除末端非編碼區序列和3’端Poly (A)尾序列外，剩余基因組主要包括6個開放閱讀框（open reading frame, ORF），從5’端到3’端依次為ORF1ab ( 20 000 bp左右)、S基因(4 100 bp左右)、ORF3(670 bp左右)、E基因(230 bp左右)、M基因(680 bp左右)、N基因(1 300 bp左右)。PEDV的結構蛋白主要包括S、E、M、N；復制酶多聚蛋白1ab（ORF1ab）和輔助蛋白（ORF3）是PEDV主要的非結構蛋白，它們僅在病毒侵染和復制過程中表達，最后并不會出現在病毒粒子中。PEDV 中唯一的輔助蛋白是ORF3，它可能與病毒毒力有關，但目前對其了解較少。ORF3基因含有一個大小約為675 nt的開放閱讀框，它編碼的非結構蛋白相對分子質量約為25.3×103，但是目前該蛋白的具體功能尚不能確定。

1.1　PEDV S基因研究進展

PEDV S基因位于ORF1ab與ORF3之間，由1 383個氨基酸組成，相對分子質量為180×103～220×103。S基因還是病毒主要的免疫原性基因，在誘導機體產生中和抗體的過程中發揮著重要作用。與其他冠狀病毒相似，含有27～29個潛在的糖基化位點,當豬流行性腹瀉病毒對宿主進行吸附和入侵過程中，S基因起著重要作用。S基因變異性較大,Lee D K等對7株韓國PEDV毒株的S基因進行序列分析發現，相比參考株序列存在15 bp基插入和9 bp缺失,且變異均發生在N末端區域；此外，用不同毒株S基因N端序列做系統進化分析與全基因序列結果具一致性，這提示S基因N端1 100 bp多樣性可用于流行毒株的分子流行病學調查和疫苗候選株篩選。例如，不同PEDV毒株中的S1基因中，均存在一段核心表位COE基因(1 495 bp～1 923 bp)，從煙草中獲取的或經乳酸桿菌表達的重組COE蛋白均能夠與PEDV天然抗原產生相同的反應原性；孫東波用兔抗PEDV多克隆抗體對PEDV S1基因特異性肽庫進行生物淘汰，鑒定出3個B細胞抗原表位(248aa-280aa、442aa-499aa、499aa-638aa)，經試驗證實，通過E.coli BL21(DE3)系統表達的以上3種不同片段編碼的融合蛋白，均能刺激小鼠機體產生中和抗體；為以S基因免疫原性區域作候選基因研發PEDV診斷試劑盒及新型疫苗奠定基礎。

1.2　PEDV S蛋白功能特性

S蛋白(spike protein) 是位于病毒粒子表面的纖突糖蛋白。S蛋白屬于1型跨膜糖蛋白，由4部分組成，分別是信號肽區(1-18aa) 、4個中和表位(499-638aa、748-755aa、764-771aa、1 368-1 374aa) 、1個跨膜結構域(1 334-1 356aa) 以及1個短的胞漿區。通過與其他冠狀病毒S蛋白同源性的對比，可以將PEDV S蛋白劃分為S1(1-798aa), S2(790-1 383aa)2個結構域。S1區包含多個病毒主要中和表位和受體結合域，與病毒抗原性和吸附入侵密切相關。S2區是S蛋白的穿膜部分,具有序列相對穩定的優勢，并且在宿主細胞膜與病毒融合的信號轉導過程中扮演著重要的角色，其融合活性在病毒對組織的親和性、對細胞的侵染能力方面起決定性作用。在對同屬于冠狀病毒科成員的SARS病毒進行研究時發現，其S蛋白的S2區內存在一段七肽重復序列(HR),通過生物信息學分析后得到結論，2個HR結構域(HR1)與(HR2)序列具有高度相似的保守性，它們通過相互作用后形成的六螺旋束能夠在病毒入侵細胞時，引起細胞膜和病毒包膜發生重排的現象，最終促使病毒膜融合。此外，研究發現S2蛋白的一個半胱氨酸區域兩旁的保守殘基C822和C833是重要的活化膜融合位點。這為PEDV S2區膜融合相關結構域的探索和病毒膜融合機制研究提供了參考。同屬于冠狀病毒科的豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）的跨膜受體均是豬氨基肽酶N(porcine aminopeptidase N,pAPN)。PEDV S1蛋白N端受體的25-88氨基酸亞基區域能特異性地結合pAPN。在PEDV感染細胞培養體系中添加pAPN會明顯提高病毒滴度。pAPN的濃度與病毒感染有著密切的關系。為全面地了解病毒入侵機制，應該對PEDV S蛋白pAPN受體進行更深入地研究。在豬傳染性胃腸炎病毒方面，Ren等利用肽庫篩選得到了多肽，它可以作為新型疫苗候選在體外抑制TGEV的感染。目前在PEDV方面尚未有相關報道，但這值得進行相關的研究。

2　基于PEDV S基因的診斷技術

由于PED與TGE有著極為相似的臨床癥狀和病理變化, 因此確診PED需要結合實驗室診斷方法。目前，用于PEDV檢測的方法有許多，比如病毒分離、免疫電鏡觀察、病毒的中和試驗、免疫熒光技術等，這些方法均能對PED做出準確的診斷, 但這些技術操作復雜而且耗時。病毒與宿主細胞吸附和受體識別的主要蛋白之一是S蛋白，且S 蛋白具良好的反應原性和免疫原性，因此在免疫學診斷技術中應用較廣。有研究表明，用N蛋白和S蛋白建立ELISA方法分別進行比較探索，發現在免疫測定中S-ELISA法更為有效。研究發現，豬感染豬流行性腹瀉后，檢測到血清中的抗N蛋白抗體遠不及抗S蛋白抗體，可在更長的時間中檢測到抗S蛋白的抗體。隨著人們對ELISA方法不斷地深入研究,該方法被廣泛地應用到臨床實踐中，此方法可用于檢測抗體，也可檢測抗原，相比較其他檢測方法，更為簡便、敏感。Gerber等根據PEDV S1蛋白的生物學特性建立了間接ELISA方法，對檢測IgA和IgG抗體都具有良好的特異性和敏感性。Paudel等根據PEDV S基因分別表達的S1蛋白、S2蛋白、S3蛋白，分別建立了ELISA方法，對400頭免疫疫苗的豬血清進行抗體水平檢測，與血清中和試驗(SN)相比，S3基因表達蛋白建立的ELISA方法更符合SN，表明S3基因是重要的中和抗原基因,在遺傳免疫中起著重要作用。Ishikawa等根據S基因序列設計了一對特異性引物，擴增出854 bp大小的目的片段, 成功地建立了診斷PEDV的RT-PCR法。S基因保守區域也可以作為檢測靶點。

3　基于S基因的疫苗研究進展

將PEDV 的S基因在煙草中進行表達，將提取的轉基因植物蛋白給小鼠注射，然后進行血清蝕斑減數中和測定，試驗結果證明S基因具有良好的免疫原性，通過用這種轉基因煙草飼喂小鼠，發現其能夠刺激小鼠產生系統免疫和黏膜免疫。以煙草花葉病毒為載體將S蛋白中和表位在無煙堿煙草中進行表達，表達蛋白接種仔豬，發現能夠誘導仔豬機體產生保護性免疫反應。這些研究成果為PEDV轉基因疫苗的開發與研究奠定了一定基礎，但是研究發現，轉基因植物自身表達抗原的效率過低，并且其生物安全性也有待進一步考究。通過以重組腺病毒和重組沙門氏菌作為活載體，構建的PEDV疫苗能夠針對病毒，產生有效地全身免疫反應和局部黏膜免疫應答。以重組PEDV S1蛋白和N蛋白的干酪乳桿菌給豬和小鼠口服，雖然不能夠誘導機體產生中和抗體，但卻能激發高水平局部黏膜IgA抗體和非中和抗體的全身免疫反應。由于活載體疫苗存在生物安全性、遺傳穩定性尚未確定的缺點，因此國際上商品化的活疫苗不常見。趙德等將PEDV S基因中具有保護性的C-COE基因片段與乳酸菌重組后進行小鼠免疫，前兩次間隔1周免疫1次，共進行3次免疫，最后一次免疫間隔2周后進行PEDV抗體檢測，試驗結果顯示以乳酸菌載體制備的疫苗，能刺激機體產生特異性抗體，此外，口服免疫途徑比注射產生高水平的抗體更容易，進一步證實乳酸菌載體疫苗更適宜于口服免疫。焦茂興等將含有PEDV疫苗株的sM、M、S基因與腺病毒進行重組構建了重組腺病毒,研制了PED口服重組腺病毒疫苗。

4　結 語

目前對PEDV S基因的研究，主要集中在基因結構分析及功能預測、蛋白免疫原性分析、遺傳進化分析等方面。經重組菌或重組病毒等多種形式表達的S基因的多個保守性中和抗原表位，在經過以小鼠作為動物模型的試驗中表現出良好的免疫原性的優勢，但同時也存在不少令人擔憂的問題，例如，重組菌或重組蛋白誘導細胞和體液免疫水平不夠顯著，與傳統疫苗相比存在保護效力不足的缺點，新型診斷方法或疫苗在臨床實踐應用較少等。此外，雖已證實pAPN為PEDV細胞受體，但關于S蛋白與pAPN受體結合后如何進行一系列信號轉導促使細胞膜重排和融合等機制還需進一步研究來揭示。